四臂昆虫嗅觉仪（果蝇）行为测定·标准化SOP

适用于四臂嗅觉仪开展果蝇趋性、忌避、气味偏好、引诱/驱避活性测定，全流程标准化、可重复、可比对，可直接用于实验记录、论文方法部分。

一、实验原理

利用四臂嗅觉仪形成气流梯度+气味梯度，果蝇随气味浓度梯度做出定向运动，通过统计各臂果蝇数量，计算趋性指数、选择率、忌避率，评价气味对果蝇的引诱或驱避效果。

二、仪器与耗材

1. 四臂嗅觉仪

2. 真空泵、流量计、硅胶管、活性炭过滤瓶、湿润瓶（去离子水）、梨形瓶

3. 果蝇麻醉管、CO₂麻醉仪、毛笔、体视显微镜

4. 滤纸、移液器、封口膜、计时器、避光黑箱

5. 供试果蝇：羽化后3–7日龄雌雄果蝇，饥饿处理2–4 h（清水饲喂，无食物）

三、环境条件（严格控制）

- 温度：25±1 ℃

- 相对湿度：60%±5%

- 光照：完全避光（果蝇趋光会干扰嗅觉选择，全程置于黑箱）

- 气流：单臂气流200–300 mL/min，四臂流速一致、无涡流、无回流

四、试剂与气味处理

1. 待测气味：挥发油、提取物、信息素、寄主气味等，用无水乙醇或石蜡油梯度稀释；

2. 对照溶剂：与溶解气味一致（乙醇/石蜡油）；

3. 滤纸裁剪：1 cm×2 cm，每臂梨形瓶内放置1张，单臂滴加10 μL待测气味/溶剂，自然挥发30 s再接入管路。

五、标准化操作步骤

1. 仪器预处理（实验前30 min）

1. 嗅觉仪、各通道用无水乙醇擦拭，通风晾干，无残留气味；

2. 连接气路：前置高分子过滤器→活性炭过滤→流量计→湿润瓶→嗅觉仪四臂梨形瓶→真空泵；

3. 调节四臂流量计，使四臂气流完全一致，运行15 min稳定气流梯度；

4. 嗅觉仪整体放入避光黑箱，避免光线干扰。

2. 分组与气味布设（标准4臂设计）

方案A（单气味vs空白对照，最常用）

- 臂1、臂2：滴加待测气味（处理臂）

- 臂3、臂4：滴加等量纯溶剂（空白对照臂）

方案B（多气味互作）

- 四臂分别设置：气味A、气味B、溶剂对照、空白空气

关键：气味臂与对照臂交替放置，消除位置偏好。

3. 果蝇引入

1. 取饥饿处理后的果蝇，轻CO₂麻醉（10–20 s，避免过度麻醉致死）；

2. 体视显微镜下挑选健康、活跃、无损伤果蝇，单次引入20–30头；

3. 迅速从嗅觉仪顶部中央释放口放入果蝇，立刻密封，开启计时；

4. 全程轻操作，禁止震动、气流突变、光线直射。

4. 行为观测与计数（标准计时）

1. 适应期：前5 min为适应阶段，不计数；

2. 正式观测：计时10–15 min，分别统计：

- 进入各臂并停留＞30 s的果蝇数量；

- 停留在中央释放区不选择的果蝇数量（记为无反应个体）；

3. 观测结束后，吸出果蝇，废弃，不重复使用。

5. 清洗与重置

1. 取出梨形瓶滤纸，嗅觉仪活动室用乙醇清洗擦拭去除残留气味、梨形瓶用乙醇清洗、超纯水冲洗、烘干；

2. 更换新滤纸、新气味，轮换臂位，避免位置偏差；

3. 每组处理重复≥5次生物学重复，每次使用新果蝇。

六、数据计算公式（统一标准）

七、关键质控要点（影响结果的核心）

1. 气流必须平衡：四臂流速差＜5%，否则形成气流偏好而非气味偏好；

2. 全程避光：果蝇趋光性极强，光线会完全干扰嗅觉结果；

3. 饥饿统一：必须饥饿2–4 h，饱食果蝇无趋性；

4. 避免残留气味：每轮必须换滤纸、清洗玻璃仪，不同气味之间间隔30 min通风；

5. 不使用受伤/衰老果蝇：羽化7日龄内，活动力正常；

6. 顺序随机化：处理与对照臂位置轮换，消除位置偏差。

八、安全与废弃物处理

1. 麻醉CO₂气瓶规范放置，通风操作；

2. 果蝇尸体密封后高压灭菌处理；

3. 有机溶剂废液统一回收，禁止直接倾倒。